มารู้จัก DNA Microsatellite กันเถอะ (ตอนที่ ๒) |
กนกพร บุญศิริชัย และ วไลลักษณ์ แพทย์วิบูลย์
กลุ่มวิจัยและพัฒนานิวเคลียร์
สถาบันเทคโนโลยีนิวเคลียร์แห่งชาติ (องค์การมหาชน)
|
เราตรวจวิเคราะห์ดีเอ็นเอ microsatellite กันอย่างไร
การตรวจวิเคราะห์ microsatellite หรือ simple sequence repeats โดยส่วนใหญ่แล้วจะเป็นการเปรียบเทียบขนาดของชิ้น microsatellite ระหว่างตัวอย่างต่าง ๆ เพื่อวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างตัวอย่างนั้น เช่น ความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการ ความสัมพันธ์เชิงครอบครัว และการจับคู่ตัวอย่างดีเอ็นเอจากสถานที่เกิดเหตุกับดีเอ็นเอจากผู้ต้องสงสัย หากเราทราบลำดับดีเอ็นเอรอบ ๆ ตำแหน่ง microsatellite วิธีที่ง่ายที่สุดในการตรวจวิเคราะห์ขนาดจะเริ่มจากการเพิ่มจำนวนโมเลกุลของ microsatellite ให้มีมากพอเพื่อที่จะสามารถมองเห็นดีเอ็นเอนั้นได้ด้วยตาเปล่าหลังการย้อมสี การเพิ่มจำนวนโมเลกุลอาศัยเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (DNA polymerase) ในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอขึ้นมาใหม่โดยมีสายดีเอ็นเอเดิมเป็นแม่แบบ (template) ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเรียกว่าปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส หรือ polymerase chain reaction (PCR) ปฏิกิริยานี้ประกอบด้วยการแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกันที่อุณหภูมิ 92-95oC (denaturation) ตามด้วยการสร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างสารเริ่ม (primer) ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ กับดีเอ็นเอแม่แบบที่อุณหภูมิ 45-65oC (primer annealing) ซึ่งเป็นการกำหนดจุดเริ่มในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ และสุดท้ายการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่อุณหภูมิ 65-72oC (polymerization หรือ primer extension) ซึ่งเป็นการต่อสารเริ่มให้ยาวออกไปโดยการเติมนิวคลีโอไทด์เข้าที่หมู่ 3-OH ของสารเริ่ม เกิดเป็นพันธะ phosphodiester ขึ้น โดยรวมแล้วในแต่ละรอบปฏิกิริยาซึ่งประกอบด้วยสามขั้นตอนดังกล่าว จำนวนโมเลกุลดีเอ็นเอจะเพิ่มขึ้นจากเดิมเป็นสองเท่า หากทำปฏิกิริยา n รอบ จำนวนโมเลกุลดีเอ็นเอจะเพิ่มจากเดิมเป็น 2n เท่า โดยทั่วไปเราจะทำปฏิกิริยา PCR ประมาณ 25-40 รอบ |
| |
 |
| |
Polymerase Chain Reaction: ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ประกอบด้วยการแยกสายดีเอ็นเอออกจากกัน (denaturation) การจับของสารเริ่มกับสายดีเอ็นเอแม่แบบ (primer annealing) และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากปลายของสารเริ่ม (polymerization) ในแต่ละรอบปฏิกิริยาจะมีโมเลกุลดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าจากเดิม
(รูปจาก http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/PCR.html) |
|
| หลังจากการทำปฏิกิริยา PCR เราจะนำดีเอ็นเอที่ได้ไปแยกขนาดในสนามไฟฟ้าโดยให้ดีเอ็นเอเคลื่อนที่ในเมทริกซ์ชนิด agarose gel หรือ polyacrylamide gel เจลทั้งสองชนิดมีโครงสร้างคล้ายร่างแห ดีเอ็นเอโมเลกุลใหญ่จะใช้เวลามากกว่าดีเอ็นเอโมเลกุลเล็กในการเคลื่อนที่ผ่านเมทริกซ์ของเจลในระยะทางที่เท่ากัน และดีเอ็นเอมีประจุเป็นลบ จึงเคลื่อนที่จากขั้วลบไปยังขั้วบวก หลังจากแยกขนาดแล้วจะนำเจลที่มีดีเอ็นเออยู่มาย้อมให้ดีเอ็นเอติดสี ทำให้เราสามารถมองเห็นและเปรียบเทียบระยะการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอตัวอย่างกับดีเอ็นเอมาตรฐานได้ |
| |
|
| |
รูปของแถบดีเอ็นเอใน agarose gel แสดงขนาดของชิ้น microsatellite (WAXY locus) ที่แตกต่างกันในลูกผสมชั่วรุ่นที่สองจำนวน 15 ตัวอย่าง ที่ได้จากการผสมข้ามสายพันธุ์ระหว่างข้าวสายพันธุ์กลายที่มาจากข้าวสุพรรณบุรี 1 กับข้าวขาวดอกมะลิ 105 โดย microsatellite จากข้าวสุพรรณบุรี 1 (SPR1) เคลื่อนที่ได้ช้ากว่าข้าวขาวดอกมะลิ 105 (KDML105) ใน agarose gel แสดงว่า microsatellite จากข้าวสุพรรณบุรี 1 มีจำนวนซ้ำของ simple sequence repeats มากกว่าข้าวขาวดอกมะลิ 105 |
|
| การย้อมสีดีเอ็นเอใน agarose gel เดิมนิยมใช้ ethidium bromide ซึ่งสามารถแทรกตัวเข้าไปจับอยู่ระหว่างชั้นของคู่เบสในดีเอ็นเอเกลียวคู่ เมื่อกระตุ้นด้วยแสงอัลตราไวโอเลต จะเห็นดีเอ็นเอเป็นแถบสีส้มแดงอยู่ในเนื้อเจล เนื่องจาก ethidium bromide เป็นสารก่อมะเร็ง ปัจจุบันจึงมีการพัฒนาสีย้อมชนิดอื่น ๆ ที่มีความปลอดภัยต่อสุขภาพมากขึ้น เช่น SYBR? Safe ซึ่งมีสภาพไว (sensitivity) เทียบเท่ากับ ethidium bromide แต่มีความปลอดภัยมากกว่า |
|
การย้อมสีดีเอ็นเอใน polyacrylamide gel นิยมย้อมด้วย AgNO3 กระบวนการย้อมสีค่อนข้างซับซ้อน ใช้เวลานาน และต้องการความชำนาญมากกว่าการย้อมสีด้วย ethidium bromide โดยดีเอ็นเอจะถูกเชื่อมโยงข้าม (crosslink) กับเนื้อเจลด้วยกรดแอซีติก แล้วจึงย้อมด้วย AgNO3 โดยดีเอ็นเอจะจับกับ Ag+ แล้วจึงทำปฏิกิริยารีดักชัน (reduction) ด้วย formaldehyde ในสภาพที่เป็นด่างเกิดเป็นโลหะ Ag ขึ้น ดีเอ็นเอจะย้อมติดสีน้ำตาลเข้ม มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า โดยทั่วไป polyacrylamide gel จะให้การแยกชัด (resolution) ของขนาดดีเอ็นเอที่แตกต่างกันได้ดีกว่า agarose gel โดยสามารถแยกชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดต่างกันน้อยถึง 1 นิวคลีโอไทด์ได้ และการย้อมด้วย AgNO3 ยังมีสภาพไวมากกว่าการย้อมด้วย ethidium bromide ทำให้สามารถตรวจวิเคราะห์ดีเอ็นเอปริมาณน้อย ๆ ได้ |
| |
|
| |
แถบดีเอ็นเอใน polyacrylamide gel ที่ย้อมติดสีน้ำตาลด้วย AgNO3 แสดงขนาดที่แตกต่างกันของ microsatellite (RM475 locus) จากข้าวขาวดอกมะลิ 105 (2 แถบซ้าย) กับข้าวขาวดอกมะลิสายพันธุ์กลาย (2 แถบขวา) |
|
| ปัจจุบันยังมีการใช้ระบบ capillary แทนการใช้แผ่นเจลเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการแยกขนาดดีเอ็นเอ การทำงานของ capillary gel electrophoresis system จะคล้ายคลึงกับ electrophoresis ทั่วไป ต่างกันเพียงแต่ดีเอ็นเอจะต้องเคลื่อนที่ผ่านหลอด capillary ขนาดเพียงไม่กี่ไมโครเมตรที่มี gel และ electrolyte อยู่ ทำให้สามารถแยกโมเลกุลดีเอ็นเอ ที่มีขนาดแตกต่างกันเพียงเล็กน้อยออกจากกัน ในระยะทางและเวลาอันสั้น เพียงประมาณสิบนาทีในบางกรณี ในขณะที่การแยกขนาดด้วย high resolution agarose gel และ polyacrylamide gel โดยใช้เทคนิคปกติ อาจต้องใช้เวลานานหลายชั่วโมง ในระบบ capillary gel electrophoresis การย้อมสีดีเอ็นเอและการตรวจวัดการติดสีจะกระทำในตัวเครื่องและจะให้ข้อมูลออกมาเป็น electropherogram หรือภาพดิจิทัลเสมือนเจลทั่วไปก็ได้ |
| |
|
| |
ตัวอย่าง electropherogram แสดงดีเอ็นเอที่มีขนาดแตกต่างกันจำนวน 3 ชิ้น
(รูปจาก http://dna.reinyday.com/464/) |
|
| |
